マルチプレックスPCRによるLegionella pneumophila血清型別法について

公開日：2024年7月31日
(IASR Vol. 45 p123-124: 2024年7月号)

レジオネラ症の感染症発生動向調査への届出の9割以上は尿中抗原検査陽性による。この場合、菌株は分離されないが、感染源の解明には環境、臨床からの菌株の分離、比較が不可欠である。2019年に血清群（SG）1以外のLegionella pneumophilaの抗原も検出できる尿中抗原検出キットの販売が開始された。レジオネラ・レファレンスセンターで収集している臨床分離株は、以前は9割以上がL. pneumophila SG1であったが、 2022年以降は、 SG1以外のL. pneumophilaがおよそ2割を占めるようになったことからも、血清型別の重要性が増していると考えられる。

L. pneumophilaは15血清群に分けられるが、血清群特異的配列プライマーを用いたマルチプレックスPCR（M-PCR）により、血清群をグループ分けする方法を開発した。このM-PCRは2段階からなり、 1段階目のM-PCRで、 SG1、 SG2、 SG3/15、 SG5、 SG6/12、 SG7、 SG8、 SG9、 SG11、 SG13、 SG14を増幅産物のアガロースゲル電気泳動のバンドサイズで判定ができる（SG3と15、 SG6と12はゲノム配列上は区別できない）。いずれの血清群のバンドも得られなかった場合は、 SG4/10プライマーを用いた2段階目のPCRを行い、バンドを確認する（バンドが得られた場合、 SG4か10と判定される。SG4と10はゲノム配列上は区別できない）。供試菌株がL. pneumophilaである場合には、 1段階目か2段階目のいずれかで血清群特異的なバンドが確認できる。以上の血清群特異的プライマーに加えて、 Legionella属特異的プライマーを併用することで、供試菌株がLegionella属菌であることを確認するとともに、 PCR反応が正しく行われているかが確認できる。スライド凝集反応でいずれのレジオネラ免疫血清にも凝集せず、型別不能と判定されるL. pneumophila菌株もM-PCRではいずれかに分類される。免疫血清による群別と区別するため、 PCRによる血清型別は、 SGの後にgを加えて、 SGg1のように記載する（表）。

日本と中国の臨床分離株、環境分離株計238株（各血清群の菌株数は、 3-48株）について、 M-PCRによる血清型別を行ったところ、デンカのレジオネラ免疫血清で群別できなかった5株を除いて、すべて免疫血清による結果と一致した。免疫血清で群別できなかった5株は、 SGg4/10が3株、 SGg6/12が1株、 SGg8が1株であった^1）。小松らの報告によると、レジオネラ免疫血清において判定不能とされた41株に対して、 M-PCRを適用したところ、 24株（58.5%）がSGg4/10/14、 7株（17.1%）がSGg1、 3株（7.3%）がSGg5、 3株（7.3%）がSGg6/12、 3株（7.3%）がSGg8、 1株（2.4%）がSGg7に血清群別され、全株がいずれかのSGgに定まった^2）。

M-PCRで増幅されるバンドサイズは、 100-1,000bpで、かつ互いに40bp以上異なるように設計されており、サイズマーカーと隣り合わせになるように泳動して、大きさを確認する必要がある。プライマー、およびポジティブコントロールかつサイズマーカーとなる人工遺伝子が販売されており、それらを用いると簡便である。

参考文献

Nakaue R, et al., J Clin Microbiol 59: e00157-21, 2021
Komatsu S, et al., Jpn J Infect Dis 76: 77-79, 2023

国立感染症研究所細菌第一部
前川純子　佐伯　歩　森田昌知　明田幸宏

東京大学医学部附属病院検査部
中植竜大

埼玉県立大学
村井美代

株式会社ファスマック
森中りえか